熒光定量PCR在肺結核臨床診斷與療效評估中地應用

1、熒光定量PCR在肺結核臨床診斷及療效評估中的應用建立熒光定量PCR檢測結核分枝桿菌方法，評估其在肺結核的臨床診斷和療效評估中的應用價值。方法針對結核分枝桿菌保守序列IS6110基因設計引物和探針，建立熒光定量PCR方法。分別以熒光定量PCR、集菌培養(yǎng)和染色鏡檢法檢測疑似肺結核和確診肺結核患者隨訪的痰標本，比較各方法在結核病診斷以及治療效果評估中的作用。結果熒光定量PCR的檢測靈敏度為4Copies/反應，遠高于抗酸染色法和集菌培養(yǎng)法。熒光定量PCR法與集菌培養(yǎng)法和抗酸染色法對臨床樣本的檢出率分別為64.29、35.12和12.5?；颊咧委熜Ч碾S訪檢測結果顯示，結核分枝桿菌的數(shù)量呈持續(xù)減少的趨

2、勢。結論熒光定量PCR方法具有快速、敏感和特異性高的特點，可以快速、及時獲取肺結核患者服藥后的治療效果，為醫(yī)生的后續(xù)督導治療提供依據(jù)，具有重要的臨床意義。結核病是全球性的重大公共衛(wèi)生問題之一。全球現(xiàn)有肺結核病人2000多萬，其中95在發(fā)展中國家1，我國是22個結核病高負擔國家之一，活動性肺結核患者居世界第2位，每年因結核病死亡的人數(shù)達到15萬人，給國家和社會帶來沉重負擔，嚴重影響我國經(jīng)濟和社會的發(fā)展2。結核分枝桿菌的實驗室檢測是結核病診斷和治療轉歸確認的重要依據(jù)。提高實驗室檢測能力，促進早診斷、早治療是有效控制結核病蔓延的必要措施。目前臨床以集菌培養(yǎng)和染色鏡檢法為主要的實驗室檢測手段。大量研究

3、表明，傳統(tǒng)方法的檢出率低、培養(yǎng)周期長，已難以滿足臨床需要3，4。熒光定量PCR是近年發(fā)展起來的一種重要的基因診斷技術，具有靈敏度高、特異性好、可定量、污染少、易于標準化等優(yōu)點。該研究建立了熒光定量PCR檢測臨床結核分枝桿菌的方法，并對熒光定量PCR在臨床肺結核診斷和療效評估中的應用進行了評價，現(xiàn)將結果報告如下。材料與方法1.1標本1.1.1疑似肺結核病患者采集2009-2010年5月某傳染病院診斷的疑似肺結核患者痰液標168份，其中男性115份，女性53份，年齡1560歲。疑似肺結核病患者的確認依據(jù)結核病診斷指南，患者出現(xiàn)咳嗽、咳痰3周或以上，可伴有咯血、胸痛、呼吸困難，或者發(fā)熱，盜汗、乏力、

4、食欲降低、體重減輕、月經(jīng)失調等癥狀，臨床需進一步做痰和胸部線檢查的患者51.1.2確診患者選擇臨床確診肺結核病患者。為確保樣本采集的連貫性，在爭取患者同意隨訪的同時，選擇暫時在家休養(yǎng)的就近患者，共選取5例活動性肺結核患者。樣本采集患者漱口后痰液，在服藥前1d即開始留樣，服藥后，在隨訪中17d內每天采集1次，后續(xù)間隔25d采集1次。1.2儀器Bact/Alert3D全自動細菌快速培養(yǎng)和藥敏檢測系統(tǒng)、Heraeus低溫冷凍離心機Megafuge1.0R、Biospec-miniDNA/RNA/Proteinanalyzer（島津）、7500熒光定量PCR擴增儀（AppliedBiosystems）

5、、凝膠成像系統(tǒng)（英國UVItec）。1.3抗酸染色法與集菌培養(yǎng)法操作參考結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程5進行。1.4痰液DNA的提取取0.5ml痰標本加入2倍樣本體積4的NaOH，液化10min后15000r/min離心5min，去上清液；向沉淀中加入0.5ml滅菌水，充分振蕩混勻，15000r/min離心2min，去上清，重復洗滌3次；沉淀中加入50lDNA提取液（1NP-40+2TritonX-100），充分振蕩混勻，100水浴10min；待冷卻至室溫，15000r/min離心5min，取上清液備用。1.5熒光定量PCR方法1.5.1引物與探針設計針對IS6110基因設計引物與探針，上游引物：5

6、-GTCGCCCGTCTACTTAATG-3，下游引物：5-GCGGATTCTTCGGTCGTG-3，產物長度為107bp。探針：5FAM-CCGACGGTGCGTAAGTGGGTGCGTCGG-DABCYL3，由XX基康生物技術XX合成。1.5.2反應條件反應體系（40l）：4.0l10buffer，7.0mmol/LMg2+，200mol/LdNTP，0.2mol/L上下游引物，0.2mol/L探針，4LDNA模板，2.5UTaqDNA聚合酶。擴增條件：943min；9420s，5220s，7220s，40次循環(huán)。試驗設定陽性對照、弱陽性對照與空白對照（notemplatecontrol,

7、NTC）。按照熒光定量PCR分析軟件設定基線（baseline）與閾值（threshold），以標準品濃度的對數(shù)值為橫坐標，Ct值為縱坐標，繪制標準曲線。1.5.3標準品制備以結核分枝桿菌H37Ra為參考菌株，PCR擴增IS6110基因并克隆到質粒載體。提取純化重組DNA，10倍梯度稀釋至107Copies/mL作為強陽性標準品，103Copies/mL作為弱陽性標準品。1.5.4特異性以結核分枝桿菌H37Ra為陽性標本，提取牛型分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、蟾分枝桿菌、草分枝桿菌、龜分枝桿菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、腦膜炎奈瑟氏菌為模板檢測引物與探針的特異性。1.5.5靈敏度與標準

8、曲線繪制抽提標準品DNA，10倍系列準確定量稀釋102107Copies/mL的DNA模板，分別取4L進行熒光定量PCR擴增，。1.5.6結果判定熒光定量PCR擴增曲線規(guī)則，呈對數(shù)增長，Ct值36即可判定為陽性；如擴增曲線不規(guī)則或Ct值40，報告為陰性；如Ct值在3640之間，且擴增曲線呈對數(shù)增長，樣本重復測定，如Ct值仍在3640之間報告為陰性。結果2.1熒光定量PCR法的特異性結核分枝桿菌H37Ra出現(xiàn)特異擴增，凝膠電泳出現(xiàn)107bp條帶。對該PCR產物進行測序，序列分析顯示為結核分枝桿菌核酸序列，其他非結核分枝桿菌擴增結果均為陰性。2.2熒光定量PCR法的靈敏度與線性以10倍梯度稀釋配制

9、原始拷貝數(shù)102107Copies/mL的標準品系列，取4L進行分子信標熒光定量PCR，繪制標準曲線，其回歸方程為Ct=-3.61344logC0+45.78456，線性X圍為4102107Copies/mL，r=0.99503，Ct值與DNA模板含量呈線性關系。經(jīng)多次重復試驗，最低可檢測4Copies/反應，見圖1。圖1熒光定量PCR法檢測結核分枝桿菌標準曲線2.3肺結核的診斷采集168份疑似結核病患者痰標本，集菌培養(yǎng)法和涂片染色法陽性檢出率分別為35.12（59/168）、12.5（21/168），熒光定量PCR法陽性檢出率64.29（108/168）。對抗酸染色法和培養(yǎng)法陽性的樣本，熒光

10、定量PCR法的靈敏度分別為100和95.4。對20份正常人群來源的痰標本，熒光定量PCR方法檢測結果為陰性，符合率為100。2.4隨訪檢測隨訪周期3個月，對5例活動性肺結核進行了動態(tài)檢測。熒光定量PCR檢測結果顯示，隨著臨床治療方案的進行，病人晨痰中結核分枝桿菌的數(shù)量呈持續(xù)下降的趨勢（即Ct值增加）。隨訪期間連續(xù)4次測定患者標本的結果，Ct值分別為26.60、27.58、28.25、29.14，呈連續(xù)增加（圖2）。為保證檢測結果的準確性，每份晨痰都進行平行測定。圖2隨訪期間熒光定量PCR連續(xù)測定肺結核患者標本擴增曲線隨訪期間，3例患者轉陰，2例仍為陽性。病例1為男性，23歲，發(fā)病時間約2個月，

11、病程較短，病情較輕，治療前X線檢查未見異常，痰涂片檢查：涂陽1+，服藥后在1個月內迅速轉陰，結核分枝桿菌從105copys/mL減少到不能檢出。病例2、3、4、5治療前X線檢查均有不同程度的異常，病程較長，患病時間在半年以上。如病例2為男性，41歲，X線檢查右上肺可見斑片狀、條索狀模糊影，密度不均，邊緣不清，其中間見一空洞，無粟粒。痰涂片檢查結果為涂陽3+，診斷為咳痰等臨床癥狀均有減輕。病例仍為陽性。隨訪各病例結核分枝桿菌III型涂陽肺結核患者。經(jīng)過3個月的治療，4例患者咳嗽、2和3涂片與熒光定量PCR檢測結果均轉陰性，病例4、5Ct值隨時間的變化曲線見圖3。圖3熒光定量PCR檢測結核分枝桿菌

12、CT值與隨治療時間變化曲線討論熒光定量PCR是近年發(fā)展迅速的基因診斷技術。與傳統(tǒng)檢測方法比較，熒光定量PCR的陽性檢出率有顯著提高，研究中熒光定量PCR與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和涂片法的陽性檢出率分別是64.29、35.12、12.5，與文獻報道一致6，7。而且熒光定量PCR法極大地縮短了檢測的時間，有助于對患者確診并及時采取治療手段8，9。目前臨床所用實驗室檢測方法十分落后，已成為阻礙我國結核病防治工作順利展開的重要原因，在基層建立和推廣特異性強、靈敏度高的檢測方法非常必要。在對5名確診結核病患者的隨訪中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過3個月的治療，3名患者痰液中不再有結核分枝桿菌檢出。另2名由于感染時間較長，并有較大程度的器質性改變，經(jīng)過治療雖未很快轉陰，但排出的結核分枝桿菌數(shù)量也有顯著減少。在隨訪監(jiān)測期間，熒光定量PCR檢測結核分枝桿菌的Ct值隨著治療的持續(xù)進行呈不