基因工程的主要技術原理

GeneticEngineering第三章基因工程的主要技術原理當前1頁，總共187頁。第三章

基因工程的主要技術原理當前2頁，總共187頁。由于提取DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實驗條件等不同，DNA的提純有很多方法。其中最常用的是堿抽提法。第一節(jié)DNA的提取與純化當前3頁，總共187頁。當前4頁，總共187頁。大腸桿菌基因組DNA當前5頁，總共187頁。一、質粒DNA的提取當前6頁，總共187頁。plasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.

GenomicDNA當前7頁，總共187頁。閉合環(huán)狀的質粒DNA，在變性后不會分離，復性快；（1）原理1.堿抽提法提取質粒DNADNA雙鏈變性DNA單鏈復性強堿中性閉合環(huán)狀的質粒DNA，在變性后不會分離，復性快；（1）原理1.堿抽提法提取質粒DNADNA雙鏈變性DNA單鏈復性強堿中性當前8頁，總共187頁。染色體線性DNA和或有缺口的質粒DNA變性后雙鏈分離，難以復性而形成纏繞的結構，與蛋白質—SDS復合物結合在一起，在離心的時候沉淀下去。變性當前9頁，總共187頁。（2）

所用的試劑作用①

溶菌酶能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的-1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH>8）下有活性。②

葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械力（震蕩）的作用而降解。（2）

所用的試劑作用①

溶菌酶能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的-1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH>8）下有活性。②

葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械力（震蕩）的作用而降解。當前10頁，總共187頁。③EDTAMg2+、Ca2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：強堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。SDS:

溶解細胞膜蛋白和細胞內蛋白，并結合成“蛋白—SDS”復合物，使蛋白質（包括DNA酶）變性沉淀。當前11頁，總共187頁。冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調到4.8。用來中和NaOH變性液，使DNA復性。高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥

乙醇DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。⑤NaAc-HAc緩沖液當前12頁，總共187頁。⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE緩沖液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。

Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖業(yè)），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。當前13頁，總共187頁。蛋白變性劑，進一步抽提DNA溶液中的蛋白質，使蛋白質沉淀。但苯酚會殘留在DNA溶液中。（現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。⑨

酚-氯仿選用以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。當前14頁，總共187頁。（3）堿抽提法提取質粒DNA的步驟

SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解細菌細胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA當前15頁，總共187頁。溶液II

破壞細胞膜，蛋白質和DNA變性。第二步：破膜，蛋白質和DNA變性SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA復性、并促使蛋白質-SDS復合物和染色體DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M醋酸鈉（用冰醋酸調pH至4.8）當前16頁，總共187頁。上清液中含有閉合質粒DNA。第四步：離心除去沉淀0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇。第五步：純化DNA上清液過柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA當前17頁，總共187頁。最重要的是：2.影響質粒DNA產量的因素菌株的遺傳背景，質粒自身的拷貝數(shù)。一般要使用endA基因發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。（1）受體菌株endA基因編碼核酸內切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可將雙鏈DNA消化成7bp的寡核苷酸片斷。當前18頁，總共187頁。這是直接決定DNA產量的重要因素之一。（3）質粒大小分子量大的質粒，拷貝數(shù)少。（2）質粒拷貝數(shù)質粒本身的性質所決定。當前19頁，總共187頁。若干常用質粒的理論產量質粒名分子大小bp拷貝數(shù)質粒產量g/ml

pGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.12若干常用質粒的理論產量質粒名分子大小bp拷貝數(shù)質粒產量g/ml

pGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.12當前20頁，總共187頁。二、基因組或其他DNA的提取

一般過程及原理：

1.細菌基因組DNA的制備（1）細胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37oC溫育。不用NaOH!當前21頁，總共187頁。（3）沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇。（2）DNA純化CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)除去多糖，酚-氯仿-異戊醇除去蛋白。當前22頁，總共187頁。

一般過程及原理：動物組織剪成小塊，置液氮中凍結后研磨成細粉末。

組織培養(yǎng)的細胞用胰酶消化松散后直接使用。（1）組織粉碎2.哺乳動物細胞基因組DNA的抽提當前23頁，總共187頁。0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50oC溫育。（2）細胞裂解（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質污染。SDS是離子型去垢劑（detergent），可以使細胞膜崩解。（5）除去RNA污染用RNase。用2倍體積的無水乙醇。（4）沉淀DNA（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）當前24頁，總共187頁。

一般過程及原理：

（1）組織粉碎用液氮冷凍后研磨成細粉末。3.從植物組織中制備DNA（2）細胞裂解用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化銨/2巰基乙醇）?；?%SDS和蛋白酶K。65oC溫育。當前25頁，總共187頁。用0.6倍體積的異丙醇（-20oC）。（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質污染。（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染用RNaseA。（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）。當前26頁，總共187頁。三、DNA的定量和純度測定1.紫外光譜法DNA（或RNA）在260nm波長處有特異的紫外吸收峰。用微量比色杯（10l）在紫外分光光度計直接測定。原理：蛋白質在280nm處有吸收峰當前27頁，總共187頁。22當前28頁，總共187頁。溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā)

紅色熒光。2.瓊脂糖凝膠電泳估計原理：與已知濃度的DNA電泳帶熒光強度對比，就可以估計出DNA含量。當前29頁，總共187頁。一般使用瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA標準混合液對比得知。DNA分子量Marker有許多公司的商品，使用非常方便。如DNA的HindⅢ酶切物等。四、DNA分子量的估計MarkerMarker當前30頁，總共187頁。DNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarkerDNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarker當前31頁，總共187頁。C

TranscriptlevelsofriceKNOXgenesOSH1andOSH3revealedbyRT-PCRinleavesfromwild-type(WT),phenotypicYAB3RNAi(Y1andY2),andWOX3overexpressionplants(W1andW2).ShootapexmRNAwasusedasapositivecontrol(S).當前32頁，總共187頁。1.帶電荷的分子在電場中會以一定的速率向與其電荷性質相反的電極移動，速度稱為電泳遷移率。2.電泳遷移率同電場的強度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比。3.電泳遷移率同分子與介質的摩擦系數(shù)成反比。

一、電泳的基本原理第二節(jié)DNA的凝膠電泳當前33頁，總共187頁。4.如果電場強度一定（電壓和電極距離）、電泳介質相同（電泳液和凝膠）：分子在電場中遷移的速度主要取決于分子本身的大小和形狀。形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關:分子量越大，移動越慢。摩擦系數(shù)主要與分子的大小、形狀以及介質的粘度有關。5.當前34頁，總共187頁。Relaxed

supercoiled

Increasingdegreeofsupercoiling

相同分子量的DNA:閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快，線性分子次之，伸展開環(huán)狀最慢。當前35頁，總共187頁。當前36頁，總共187頁。當前37頁，總共187頁。Agarosegelelectrophoresis

Gelelectrophoresisisnotonlyusedasananalyticalmethod,itisroutinelyusedpreparativelyforthepurificationofspecificDNAfragments.Thegeliscomposedof:

Agarose:forDNAfragmentsranginginsizefromafewhundredbasepairstoabout20kb(Fig.2.1).

Polyacrylamide:forsmallerDNAfragments.當前38頁，總共187頁。Fig.2.1ElectrophoresisofDNAinagarosegels.DNAbandshavebeenvisualizedbysoakingthegelinasolutionofethidiumbromide(seeFig.2.2),whichcomplexeswithDNAbyintercalatingbetweenstackedbase-pairs,andphotographingtheorangefluorescence.當前39頁，總共187頁。Fig.2.2Ethidiumbromide.

當前40頁，總共187頁。Agarosegelisacomplexnetworkofpolymericmoleculeswhoseaverageporesizedependsonthebuffercompositionandthetypeandconcentrationofagaroseused.當前41頁，總共187頁。Inanyevent,gelelectrophoresisisfrequently

performedwithmarkerDNAfragmentsofknown

size,whichallowaccuratesizedeterminationofan

unknownDNAmoleculebyinterpolation(插入).

InadditiontoresolvingDNAfragmentsofdifferentlengths,gelelectrophoresiscanbeusedtoseparatedifferentmolecularconfigurationsofaDNAmolecule.當前42頁，總共187頁。Gelelectrophoresiscanalsobeusedforinvestigatingprotein–nucleicacidinteractions,basedontheobservationthatbindingofaproteintoDNAfragmentsusuallyleadstoamobilityreduction.當前43頁，總共187頁。二

、瓊脂糖凝膠電泳1.瓊脂糖2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨”。是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產物瓊脂中提取而來。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。

濃度高空隙小當前44頁，總共187頁。瓊脂糖的濃度（%）分離DNA的片斷大?。╞p）0.30.71.450000—100020000—10006000—300空隙小，分辨率高：小分子較易通過，而大分子難通過；空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過。3.瓊脂糖凝膠的分辨力空隙大小決定其分辨分子大小的能力。當前45頁，總共187頁。

1、概述：聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（簡稱Acr）單體和少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）通過化學催化劑（過硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加速劑或光催化聚合作用形成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網狀結構。具有濃縮效應、電荷效應、分子篩效應。適用于不同相對分子質量物質的分離，且分離效果好。三

、聚丙烯酰胺凝膠電泳當前46頁，總共187頁。優(yōu)點是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）分離DNA片斷大小（bp）4.010.020.01000—100500—2550—1三

、聚丙烯酰胺凝膠電泳其優(yōu)點是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）分離DNA片斷大?。╞p）4.010.020.01000—100500—2550—1瓊脂糖凝膠電泳：1000——50000bp聚丙烯酰胺凝膠電泳：1——1000bp當前47頁，總共187頁。2、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）原理與裝置（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在電場的作用下線性蛋白質鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質中向正極移動，移動的速率主要取決于其分子量大?。ㄦ湹拈L短），從而把不同分子量的肽鏈分開。電泳buffer電泳buffer當前48頁，總共187頁。電泳方向當前49頁，總共187頁。當前50頁，總共187頁。已知分子量的蛋白質混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質提供分子量估計。商品化供應Da道爾頓(質量單位,等于一氧原子質量的十六分之一。一克約為6×1023道爾頓3、蛋白質電泳的分子量標準當前51頁，總共187頁。DaltonSDSPAGE當前52頁，總共187頁。4、凝膠中的蛋白質染色：考馬斯亮藍：靈敏度底、只能檢出>0.3-1μg/帶，但可褪色回收。

硝酸銀：靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。2）轉到膜上進行染色。1）直接染色當前53頁，總共187頁。直接染色電泳結果當前54頁，總共187頁。四、凝膠染色1.染料溴化乙錠。Ethidiumbromide（EB）當前55頁，總共187頁。EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結合。EB在300nm紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。熒光強度與DNA含量及大小成正比。2.原理當前56頁，總共187頁。

當前57頁，總共187頁。當前58頁，總共187頁。UVP全自動凝膠成像分析系統(tǒng)當前59頁，總共187頁。OMEGA8-LOGO全自動凝膠成像分析系統(tǒng)當前60頁，總共187頁。

核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復后又可依堿基配對規(guī)律形成雙邊結構。雜交通常在一支持膜上進行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測樣品的不同又被分為DNA印跡交（Southernblothybridization）和RNA印跡雜交（Northernblothybridization）。第三節(jié)

核酸的分子雜交

當前61頁，總共187頁。DNA-DNA或DNA-RNA鏈雜交。用放射性同位素（32P或125I）標記的DNA或RNA探針。當前62頁，總共187頁。

Southern雜交的基本原理是將待檢測的DNA分子用/不用限制性內切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。

一、Southernblot當前63頁，總共187頁。Southernblot用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品。當前64頁，總共187頁。當前65頁，總共187頁。當前66頁，總共187頁。Southernblot篩選結果當前67頁，總共187頁。二、Northernblot用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。

在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同SouthernBlot相同的原理進行轉膜和用探針進行雜交檢測。其用途是檢測樣品中是否含有基因的轉錄產物（mRNA）及其含量。主要檢測插入片斷是否被轉錄。當前68頁，總共187頁。

蛋白質印跡(westernblot)，又稱免疫印跡(immunoblotting)是根據(jù)抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。

WesternBlot基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中的表達情況。WesternBlot采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。三、WesternBlot＃當前69頁，總共187頁。Westernblotting電泳膠里的蛋白質帶可以用電轉的方法，轉到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等）。①Western（轉膜）膠里的蛋白質帶在電場的作用下橫向轉移到正極一側的膜上。膜膠蛋白當前70頁，總共187頁。②Blotting原理與ELISA相同。待測蛋白硝酸纖維素膜一抗二抗辣根過氧化物酶底物產物，并發(fā)出光PAGE膠待測蛋白底片曝光辣根過氧化物酶：HRPO當前71頁，總共187頁。當前72頁，總共187頁。1）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與

膜上的蛋白結合。2）洗去未結合的一抗。3）用二抗與一抗結合（二抗上帶有HRPO）。4）清洗掉未結合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，沖洗膠片。③Blotting過程ImmunoBlotting當前73頁，總共187頁。④結果多克隆抗體Blotting的結果單抗blotting結果當前74頁，總共187頁。四、

原位雜交對應的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。需要目的基因的探針。當前75頁，總共187頁。3當前76頁，總共187頁。第四節(jié)

基因

擴增技術PCR一、基因擴增（geneamplification)指生物體內或體外人工方式使基因拷貝數(shù)大規(guī)模增加。有下列五種方式：1.環(huán)境誘發(fā)擴增2.基因的程序性擴增5.PCR擴增3.基因組進化擴增4.基因工程擴增當前77頁，總共187頁。1.環(huán)境誘發(fā)擴增如氨甲喋呤誘發(fā)二氫葉酸還原酶基因擴增。在環(huán)境因子的誘發(fā)下，某些基因產生明顯的擴增。在發(fā)育的某個階段，某些基因的大量擴增。2.基因的程序性擴增如非洲爪蟾卵子形成過程中rRNA基因的擴增。當前78頁，總共187頁。生物進化過程中基因組中某些基因的拷貝數(shù)增加，結果相關的基因聚集成簇。5.PCR擴增應用聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）技術，在體外特異性地擴增某個基因。3.基因組進化擴增4.基因工程擴增載體攜帶目的基因在寄主細胞中大量復制。當前79頁，總共187頁。（1）1.PCR的發(fā)明二、PCR技術（2）Mullis由此獲得1993年諾貝爾化學獎。1985年Cetus公司的科學家K.B.Mullis發(fā)明了PCR，使這一設想變成現(xiàn)實。1971年Khorana提出體外人工復制DNA的設想。當時由于引物和DNA聚合酶及DNA測序技術都沒有解決，設想未能實現(xiàn)。PolymeraseChainReaction當前80頁，總共187頁。當前81頁，總共187頁。（3）TaqDNA聚合酶1988年R.K.Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反應中。使

PCR自動循環(huán)儀成為可能。（4）PCR儀1988年Cetus公司發(fā)明自動熱循環(huán)儀。1986年H.A.Erilish從嗜熱

水生菌分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37oC)，PCR技術才進入實用階段。當前82頁，總共187頁。當前83頁，總共187頁。PCR儀當前84頁，總共187頁。2.PCR技術的原理模板DNA變性引物DNA復性引物DNA延伸當前85頁，總共187頁。雙鏈DNA在受熱后，配對堿基的氫鍵斷裂，DNA兩條鏈分開成為單鏈。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

TAGAACTTGACGTACGTA95oC（1）DNA模板變性模板模板（template）95oC當前86頁，總共187頁。TGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

TAGAACTTGACGTACGTA3’

人工合成的單鏈DNA小片斷，堿基順序分別與所要擴增的模板DNA雙鏈的5‘端相同。（2）DNA模板與引物復性模板模板ATCTTGAAC5’

3’

ACGTACGTA5’

3’

引物引物引物（primer）:40-65oC當前87頁，總共187頁。DNA聚合酶按堿基配對原則在模板上延伸DNA鏈。（3）DNA鏈的延伸TGCATGCATATCTTGAAC3’

5’

5’

TAGAACTTGACGTACGTA3’

模板模板ATCTTGAAC5’

ACGTACGTA5’

TaqTaq72oC當前88頁，總共187頁。理論上25-30次循環(huán)就可以合成225-230條DNA。變性—復性—延伸。（5）1個循環(huán)的結果（4）新一輪循環(huán)開始DNAelongation當前89頁，總共187頁。3.PCR的過程（1）第一步

變性（denature）94-95oC下5分鐘，模板DNA雙鏈完全變性成單鏈。（2）第二步

復性（anneal）50-60oC下1分鐘，引物優(yōu)先與模板復性。①引物的濃度高，②引物的鏈短。當前90頁，總共187頁。94oC下1分鐘，新合成的DNA雙鏈又變性成單鏈模板。（4）第四步

變性（denature）72oC下1-2分鐘，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（3）第三步

延伸（extend）（5）第五步

重復（repeat）當前91頁，總共187頁。第二步——第三步——第四步復性延伸變性95oC5min50oC1min72oC2min94oC1min溫度循環(huán)當前92頁，總共187頁。PCR儀的溫度循環(huán)程序當前93頁，總共187頁。當前94頁，總共187頁。PCR當前95頁，總共187頁。需要的模板量極低。4.PCR的特點（1）特異性強

①PCR使用專門合成的DNA引物。②延伸過程是在高溫下進行。（2）敏感性高

這就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特異性。理論上只要一條模板鏈，32次循環(huán)就可合成約109條！當前96頁，總共187頁。RT-PCR：對模板的純度要求低。（5）可以擴增mRNA（4）簡便

先用逆轉錄酶將mRNA合成cDNA，再以cDNA為模板進行擴增。（3）快速

整個PCR過程約4小時即可完成。不需要純化，甚至可以直接用細菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。當前97頁，總共187頁。自從H.A.Erilish分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶，代替大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片斷（37oC)，PCR技術才進入實用階段。（1）TaqDNA聚合酶

5.影響PCR的因素TaqDNA聚合酶的最大特點是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合PCR過程的反復高溫變性要求。①

熱穩(wěn)定性當前98頁，總共187頁。最適溫度：

75-80oC

延伸速度：

約35-150nt/s.酶分子最長延伸長度：6.7kb②

最適溫度高③Taq酶的功能缺點具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但沒有3‘5’外切酶活性。因此不能修復錯誤的堿基配對！

合成超過600bp長度的DNA就有可能出現(xiàn)錯配，用于克隆基因時必須測序。當前99頁，總共187頁。金屬離子敏感（尤其是Mg2+

）。當dNTP（能結合Mg2+）的濃度為時，MgCl2的最佳濃度應是2.0mmol/L。④TaqDNA聚合酶的激活劑50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。4金屬離子敏感（尤其是Mg2+

）。當dNTP（能結合Mg2+）的濃度為時，MgCl2的最佳濃度應是2.0mmol/L。④TaqDNA聚合酶的激活劑50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。4當前100頁，總共187頁。（2）其它耐熱的DNA聚合酶

①TthDNA聚合酶無3’5’DNA外切酶活性，但高溫下能逆轉錄cDNA，又能擴增DNA。②VENTDNA聚合酶有3‘5’外切酶活性，能夠校正堿基的錯配。能耐受100oC高溫。當前101頁，總共187頁。③PfuDNAPolymerase④

TaqPlusDNAPolymerase有3’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性。但PCR產物為平端！

是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA聚合酶中出錯率最低的。是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物。

Taq的PCR產物3’端往往帶有一個A。當前102頁，總共187頁。與待擴增的模板DNA區(qū)段的兩3’端序列互補（

5‘端相同）的短DNA。（3）引物（primer)①位置3’

3’

當前103頁，總共187頁。即2.751011bp的基因組中有一次完全與19個核苷酸的序列相同的機會（或機會是約2×10-11）。②引物的長度理論計算：419=2.751011。一般引物設計為長15—30bp。當前104頁，總共187頁。③引物的堿基序列

5’端根據(jù)需要可設計成某個內切酶的切點順序、RNA聚合酶識別序列、突變位點或生物素標記等，方便與以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’

3’GCTAGCTACTTAAG5’

3’端必須與模板正確配對，5’端可以不配對。templateprimer當前105頁，總共187頁。盡可能提高G+C含量，以提高引物與模板的結合力;④引物的堿基組成避免連續(xù)相同堿基排列或內部回文序列。5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’

CTGCCAGTCTAC3’

GACGG5’

T發(fā)卡結構1）2）當前106頁，總共187頁。3）避免形成引物二聚體（dimer）。兩個引物之間不能有兩個以上的連續(xù)堿基序列互補。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’

3’CAGGACTTAGTCACT5’

primer1primer2UpstreamprimervsDownstreamprimerSenseprimervsAntisenseprimerPrimer1vsPrimer2ForwardprimervsReverseprimer當前107頁，總共187頁。⑤引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2當引物中的（G+C）含量低于50%時，復性溫度低于55oC。適當提高復性溫度可以提高引物與模板結合的特異性，減少非特異產物的出現(xiàn)。實際復性溫度選擇低于Tm值5oC。手工計算：一般估計：當前108頁，總共187頁。⑥引物的濃度一般使用終濃度各0.5mol/L。⑦簡并引物如果引物的序列是從基因產物蛋白質的氨基酸序列反推出來的，就必須考慮密碼的簡并性。需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個或幾個堿基差異。這樣的混合引物稱簡并引物。當前109頁，總共187頁。設計多組引物，結合位點依次位于前一組引物之間。增加擴增產物的特異性。引物設計現(xiàn)在多用專業(yè)軟件

⑧套嵌引物（nestedprimers)1324如Primer5.0等當前110頁，總共187頁。Primer5.0當前111頁，總共187頁。當前112頁，總共187頁。當前113頁，總共187頁。當前114頁，總共187頁。當前115頁，總共187頁。當前116頁，總共187頁。當前117頁，總共187頁。當前118頁，總共187頁。當前119頁，總共187頁。當前120頁，總共187頁。當前121頁，總共187頁。當前122頁，總共187頁。當前123頁，總共187頁。但不能有蛋白質變性劑、DNA酶、Mg2+的螯合劑等影響DNA聚合酶的活性。（4）模板（template)②

模板的量：不能太多，100l反應體系中100ng足夠。①

純度：PCR對模板DNA的純度要求不高。當前124頁，總共187頁。dNTPs是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的總稱。（5）dNTPs一般反應體系中dNTPs混合液終濃度用0.2mmol/L。濃度過高會抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加錯配率。當前125頁，總共187頁。TaqDNA聚合酶要求有游離的Mg2+

。（6）Mg2+

的濃度

所以Mg2+濃度不能太低。但太高會增加非特異產物（雜帶）。一般用的MgCl2終濃度。當前126頁，總共187頁。借助于熒光信號來檢測PCR產物?？梢宰龅絇CR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴增曲線，準確地確定CT值，從而根據(jù)Ct值確定起始DNA的拷貝數(shù)，做到真正意義上的DNA定量。

6.PCR技術的擴展（1）熒光實時定量PCRReal—time

PCR（或TaqMan

PCR）Ct值：樣品到達域值水平所經歷的循環(huán)數(shù)。

當前127頁，總共187頁。擴增兩個引物外側的未知序列（2）反向PCR把線性DNA模板轉變成環(huán)形分子。templatetemplate3’

5’

5’

3’

（傳統(tǒng)PCR只擴增兩個引物質之間的已知序列）。技術關鍵：當前128頁，總共187頁。使引物的外側序列“轉變”成內側序列。當前129頁，總共187頁。低濃度的引物（限制引物）首先被用完，隨后只有高濃度的引物，繼續(xù)合成單鏈DNA。最后產物中99%是單鏈DNA。（3）不對稱PCR3’

5’

5’

3’

引物少用于擴增單鏈DNA，單鏈DNA更適于測序。技術關鍵：兩個引物的濃度相差100倍。當前130頁，總共187頁。擴增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。（4）反轉錄PCR（RT-PCR)Temin,H.發(fā)現(xiàn)反轉錄酶，1975諾貝爾獎技術關鍵：利用反轉錄酶，把RNA反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。當前131頁，總共187頁。RNAtemplate3’

5’

下游引物cDNAfirststrand3’

5’

上游引物cDNAfirststrandcDNAsecondstrand3’

5’

3’

5’

反轉錄酶Taq酶PCRReversetranscription(RT)下游引物上游引物Taq酶當前132頁，總共187頁。Fig.3.RT-PCRanalysisofGbd1andGbd2inPima90followinginfectionbyV.dahliaeafter0,2,4,8,12,24,48,72and96h,respectively.M:100bpDNAladder.his-3ofcottonasthecontrol.當前133頁，總共187頁。7.PCR技術的應用（1）擴增某一段DNA從基因組中擴增；從載體上擴增；組織樣本原位擴增；微量殘留DNA擴增；分析模板序列；當前134頁，總共187頁。在基因的某處引入核苷酸突變（缺失、重復、插入、替換等）。（2）基因的體外誘變技術關鍵：利用引物的5‘端序列不要求與模板嚴格配對，設計引物時引入突變序列。在基因的某處引入核苷酸突變（缺失、重復、插入、替換等）。（2）基因的體外誘變技術關鍵：利用引物的5‘端序列不要求與模板嚴格配對，設計引物時引入突變序列。在基因的某處引入核苷酸突變（缺失、重復、插入、替換等）。（2）基因的體外誘變技術關鍵：利用引物的5‘端序列不要求與模板嚴格配對，設計引物時引入突變序列。當前135頁，總共187頁。設計引物定點誘變當前136頁，總共187頁。利用6bp長度的隨機序列引物擴增細胞中的總DNA，將會得到許多非特異性產物，反映了該引物序列在基因組中的分布狀況。（3）基因組的比較研究

比較不同物種之間的基因組特征和相似性。類似于限制性內切酶片斷長度多態(tài)性（RFLP）分析，因而也稱為隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）分析。RAPD(RandomamplifiedpolymorphismDNA)當前137頁，總共187頁。1970年人們就有足夠的理論知識來提出目前所用的快速DNA序列分析法。但當時在認識上和技術上存在兩個問題：當時沒有能把不同長度的核苷酸片斷分離開的技術。當時的分析思路局限于RNA序列分析法。第五節(jié)DNA序列分析（1965年Cornell大學的S.W.Holley等首次測定了75bp的酵母丙氨酸t(yī)RNA全序列。使用的是降解片斷法）。5當前138頁，總共187頁。Sanger等1977年發(fā)明。一、雙脫氧鏈終止法FrederickSanger,1980年NobelPrize化學獎當前139頁，總共187頁。（1）DNA復制是以一條鏈為模板，按堿基配

對的原則進行的。（2）脫氧核糖的連接是以3’5’磷酸二脂鍵。（3）復制反應可以在體外進行。（4）2’和3’雙脫氧的ddNTP會使復制反應終

止。1.原理

當前140頁，總共187頁。當前141頁，總共187頁。當前142頁，總共187頁。（1）制備單鏈DNA模板2.技術要點

就是待測序的DNA鏈。①不能有5’3’和3’5’的外切酶活性；②與模板的親和力高，不會提前脫離模板。

（3）特殊的DNA多聚酶dNTP/ddNTP=100/1

（4）制備2’和3’雙脫氧的ddNTP時,DNA電泳帶譜的分離效果最好，可讀出200多個核苷酸序列。當前143頁，總共187頁。需帶有放射性或熒光標記。（2）制備一小段單鏈引物（DNA或RNA）當前144頁，總共187頁。3.Sanger雙脫氧終止法測序過程當前145頁，總共187頁。當前146頁，總共187頁。模板序列當前147頁，總共187頁。1977年，哈佛大學的A.M.Maxam和W.Gilbert發(fā)明。二、Maxam-Gilbert化學修飾法WalterGilbert,1980年NobelPrize化學獎當前148頁，總共187頁。末端放射性標記的DNA片單鏈長度只差一個核苷酸的DNA鏈混合物化學試劑處理凝膠電泳放射性自顯影閱讀堿基順序特定的堿基中引入化學基團DNA在被修飾的核苷酸位置斷裂1.原理

當前149頁，總共187頁。堿基特異修飾方法GpH8.0,用硫酸二甲脂對N7進行甲基化，使C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0,哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化，從而導致脫嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán)，后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易于除去C在1.5mol/LNaCl存在時，可用肼除去胞嘧啶2.堿基特異的化學修飾法

當前150頁，總共187頁。反應切割堿基修飾修飾堿基的轉移DNA鏈的斷裂R1G>A硫酸二甲脂pH7.0加熱氫氧化鈉R2A>G硫酸二甲脂酸氫氧化鈉R3C+T肼六氫吡啶六氫吡啶R4C肼+鹽六氫吡啶六氫吡啶R5G硫酸二甲脂六氫吡啶六氫吡啶R6G+A酸酸六氫吡啶R7C+T肼六氫吡啶六氫吡啶R8C肼+鹽六氫吡啶六氫吡啶R9A>C氫氧化鈉六氫吡啶六氫吡啶R10G>A硫酸二甲脂pH7.0加熱六氫吡啶R11G亞甲藍六氫吡啶六氫吡啶R12T四氧化鋨六氫吡啶六氫吡啶3.堿基特異的化學切割法

當前151頁，總共187頁。4.測序過程

當前152頁，總共187頁。每組反應只針對特定的堿基，共有4組反應，可分別顯示G、A+G、C、C+T的終止位置。特點：讀出的序列就是要測的序列。Sanger測序法讀出的序列是新合成的互補鏈序列。當前153頁，總共187頁。當前154頁，總共187頁。當前155頁，總共187頁。測序讀片當前156頁，總共187頁。90年代初期由英國、前南斯拉夫和俄羅斯的4個科學家小組同時提出來的。1.原理

（1）只有完全互補的DNA序列才能雜交形

成完全的雙鏈分子。雜交效率最高。三、DNA雜交測序（2）有個別不互補堿基時，雜交效率下降。（3）非互補堿基越多，雜交效率越差。當前157頁，總共187頁。（4）用一段寡居聚苷酸（8-mer）的所有可能的堿基排列序列作探針。8mer探針有48=65536種序列。如：8-mer靶DNA同65536中的一種探針完全雜交形成完全互補雙鏈。

（5）根據(jù)雜交效率可推斷出靶DNA的序列。5’-AGCCTAGC-3’

Target3’-TCGGATCG-5’

Probe假如探針序列已知，則可推知靶DNA序列。

當前158頁，總共187頁。但：12mer靶DNA與8-mer探針雜交，將會有5種探針與之形成完全互補雙鏈。3’-TCGGATCG-5’

3’-CGGATCGA-5’

3’-GGATCGAC-5’

3’-GATCGACT-5’

3’-ATCGACTT-5’

5’-AGCCTAGCTGAA-3’

12-mertarget8-merprobe假如知道能與之完全雜交的所有5種探針序列，就可推知12bp的靶DNA序列。當前159頁，總共187頁。（1）DNA芯片（chip）把寡聚核苷酸探針的3‘端或5’端與玻璃或凝膠形成共價連接。目前可以做出65536種8-mer探針芯片。2.技術要點

每種探針的序列和位置已知，可被電腦讀出。當前160頁，總共187頁。當前161頁，總共187頁。DNAchip雜交當前162頁，總共187頁。（1）非放射性標記1981年第一臺商業(yè)化生產的DNA自動測序儀誕生。四、DNA自動化測序熒光物質標記。用激光能激發(fā)出不同顏色的熒光。1.技術要點（2）不同的標記對象既可標記引物，也可標記ddNTP。當前163頁，總共187頁。（4）分析自動化（3）讀片的自動化激光探頭直接讀膠，實時閱讀。（2）反應的自動化Sanger脫氧終止法。電腦自動把熒光信號轉化成對應的堿基，并打印出DNA序列。（5）反應可在一個試管中進行標記ddNTP時。當前164頁，總共187頁。2.熒光標記引物的自動化測序①分別用4種熒光物標記引物，②區(qū)分反應產物，③混合電泳，④激光一次讀膠，⑤電腦合成結果。當前165頁，總共187頁。當前166頁，總共187頁。3.熒光標記ddNTP自動測序原理圖解4種不同的熒光物分別標記4種ddNTP。當前167頁，總共187頁?？稍谕还苤羞M行當前168頁，總共187頁?？稍趩我挥镜离娪尽．斍?69頁，總共187頁。熒光標記終止法測序當前170頁，總共187頁。測序結果當前171頁，總共187頁。毛細管測序儀日本開發(fā)的世界上最高速DNA測序儀?？赏瑫r解析384個樣品！標記法：4色熒光、引物標記/終端標記。測序長度：600bp/毛細管6毛細管測序儀日本開發(fā)的世界上最高速DNA測序儀?？赏瑫r解析384個樣品！標記法：4色熒光、引物標記/終端標記。測序長度：600bp/毛細管6當前172頁，總共187頁。第六節(jié)

酵母雙雜交系統(tǒng)YeastTwoHybridSystem(Interactiontrap)90年代，紐約大學的S.Field等建立。當前173頁，總共187頁。雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物轉錄起始過程調控的認識。

GAL4activationdomainLexDNA-bindingdomainGAL1operatorLacZasreporterUASGGAL1operatorLacZasreporterGAL1operatorLacZasreporterLexAenhancer1、真核生物轉錄激活過程GAL4AD+BD融合蛋白（fusionprotein）

(GAL4AD+LexABD)當前174頁，總共187頁。GAL1operatorLacZasreporterUASGGAL1operatorLacZasreporterGAL1operatorLacZasreporterLexAβ-galactosidase1800unitsNothing520unitsGAL4GAL4-LexAGAL4+UASGenhancingGAL1LacZNoactivatornoLacZexpressingLexA+LexA.GAL4activation

GAL1LacZexpressingenhancer當前175頁，總共187頁。（1）轉錄激活因子在結構上是組件式的(modular)，即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成，其中有DNA結合結構域(DNAbindingdomain,簡稱為BD)和轉錄激活結構域(activationdomain,簡稱為AD)，它們是轉錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。FunctionofactivationdomainrecruitmenttheRNApolymerasetopromoter.GAL1ope