PCR污染防治手冊

1、PCR污染防治手冊為什么要如此重視防治PCR污染?聚合酶鏈反應(yīng)(P olymerase chain reactio n,P CR)是 一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的方法。擴增過程中，擴增的DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的。PCR產(chǎn)物的濃度一般為1013 拷貝/ml，而1mg人基因組DNA才含1.4*10 6拷貝的單拷貝基因片段，因此使得PCRT增反應(yīng)的敏感性非常高。正是由于PCR反應(yīng)具有強大的擴增效率也導(dǎo)致其及易污染，極微量的PCR產(chǎn)物污染便可導(dǎo)致假陽性結(jié)果。在應(yīng)用HPV分型試劑盒的過程中，主要存在兩個污染源：1012拷貝個分子， 0.1 ml 稀釋液含 因此，一定要注意1. 標(biāo)本間的交叉污染

2、； 2.PCR 擴增產(chǎn)物的污染。其中以第二個污染源為最為常見，通過下 面一個例子便可認(rèn)識到 PCF產(chǎn)物污染的嚴(yán)重性。在100ml的反應(yīng)管中可產(chǎn)生 若將這些分子在一個標(biāo)準(zhǔn)奧林匹克游泳池(50m*25 m *2m)內(nèi)稀釋后，有400拷貝的擴增分子，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了 PCRT增反應(yīng)檢測數(shù)個拷貝的極限。 產(chǎn)物殘留污染的問題，對臨床實驗室尤應(yīng)如此。PCF污染的來源對于HPV分型檢測試劑盒來說，污染的來源主要是 PCR擴增產(chǎn)物的污染，常見的污染途 徑有兩種， 一是氣溶膠污染 ，在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠， 在操作時比較劇烈地 搖動反應(yīng)管， 開蓋時、 吸樣時及受污染的進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。

3、 據(jù)計算 一個氣溶膠顆?？珊?48000 拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。二是 PCR產(chǎn)物的粘帶污染，此類污染多是因為沒有嚴(yán)格遵守分區(qū)規(guī)定，造成PCR產(chǎn)物擴散到樣品抽提或PCR實驗室。實驗大衣、手套、移液槍、槍頭、槍頭盒和試管架都是常見的粘帶污染 源。污染發(fā)生時，這些地方是重點懷疑的地方。PCF污染的追蹤如果不慎發(fā)生或者懷疑有污染發(fā)生，可以設(shè)計一個簡單的小實驗以確認(rèn)污染源。用HPV的PCR擴增系統(tǒng)擴增如下模板：A: 水- 作為陰性對照，如果此管擴增出陽性，則可以判定為試劑已經(jīng)污染或者是氣溶 膠污染。B: 陽性樣品 - 作為陽性對照，驗證實驗是否成功。0.1ml 去離子槍頭盒、

4、試管C-X:- 所要檢查的地方，用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源， 水浸泡后作為模板。常見的需要檢查的地方為各個 實驗臺面、移液槍、槍頭、 架、冰箱內(nèi)、冰箱把手、水浴鍋、抽提的相關(guān)試劑以及相關(guān)人員的辦公桌。PCR 產(chǎn)物如果經(jīng)過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中 的氣溶膠造成的， 此時就應(yīng)該更換實驗場所， 若條件不允許， 可以在室內(nèi)加裝紫外燈管照射 過夜且徹底通風(fēng)并停止幾天的實驗。四、PCR虧染的預(yù)防進(jìn)行PCR操作時，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的 PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。1劃分操作區(qū)：實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和

5、后處理要在不同的隔絕對不可離區(qū)內(nèi)進(jìn)行，最基本的一個原則就是 PCR擴增及雜交檢測區(qū)的東西是屬于污染源， 以帶到前兩個區(qū)去。A:樣品制備區(qū)，包括擴增摸板的制備；B: PCR加樣區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和 PCR擴增；C: PCRT增及雜交檢測區(qū)，雜交操作過程在這個地方完成。分區(qū)的注意事項：如：標(biāo)本制備7PCR 擴增各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。7產(chǎn)物分析7產(chǎn)物處理。樣品的保存應(yīng)該在上述三個區(qū)以外單獨的區(qū)域。各個區(qū)域的物品及衣服必須嚴(yán)格遵守單向的原則。各個區(qū)域必須要自己單獨的實驗衣，實驗時必須戴上手套。每個區(qū)域要有自己單獨的實驗設(shè)備。以下是常見的分區(qū)方式：PCR擴增及雜交檢測

6、緩沖間PCR加樣區(qū)樣品制備區(qū)PCR擴增及雜交檢測區(qū)樣品制備及PCR加樣區(qū)i-緩沖間I緩沖間緩沖間緩沖間圖一PCR加樣區(qū)樣品制備區(qū)PCR 擴增及雜交檢測區(qū)圖二、圖三PCR擴增及雜交檢測區(qū)樣品制備區(qū)走廊PCR加樣區(qū)圖二圖四2、實驗操作的注意事項：A: 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；B: 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與 PCR 產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中， 避免氣溶膠的污染；C: 避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不 小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；D: 操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證 PCR 反

7、應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增 系統(tǒng)的可信性；E:盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染， 最好使用可替換或高壓處理的加樣器。 如沒有這種特殊的加樣器， 至少應(yīng)經(jīng)常的擦洗 槍外表及槍管內(nèi)。3、嚴(yán)格對PCR產(chǎn)物的處理：PCR產(chǎn)物包括雜交產(chǎn)物， 在讀數(shù)結(jié)束后，雜交產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物應(yīng)該用一次性密閉容器 （垃 圾袋、自封袋）裝好后丟棄或者倒至 1 mol/L HCl 溶液或 1:25 的 84消毒液中，浸泡半小時 以上后再行丟棄。如果有產(chǎn)物濺在了桌面或器具上，應(yīng)立即用 1 mol/L HCl 溶液或 1:25 的 84 消毒液擦拭。4、根據(jù)實驗室情況建立完善

8、的日常PCR防治制度并嚴(yán)格執(zhí)行事在人為，制度執(zhí)行了才能達(dá)到它應(yīng)有的效果，根據(jù)實驗室實際情況建立制度后必須嚴(yán) 格執(zhí)行，絕對不能因為圖方便放松警惕。五、PCF污染后的處理1.2.3.如果是器具的污染， 可以對可疑器具用 1mol/L 鹽酸或者 1:25 的 84消毒液擦拭或浸泡。 如果臺面污染，可能的話用紫外燈照射過夜。如果是試劑污染請更換試劑，但試劑污染一般伴隨著器具污染，務(wù)必查找出污染源并及 時處理。對于被污染的區(qū)域，最好更換實驗場所，可能的話應(yīng) 加裝紫外燈照射過夜，實在不行也 必須加強通風(fēng)幾天，并停止實驗后檢測是否還有污染六、實驗室實例：1、分區(qū)情況：實驗室分成兩個區(qū)，類似圖二所示。因為條件

9、所限，沒有設(shè)置緩沖區(qū)，但兩個區(qū)相隔較 遠(yuǎn)，可以有效避免汽溶膠的傳播。2、規(guī)章制度：A: 定期監(jiān)測： 使用棉簽涂抹的方法，一個月一次定期監(jiān)測，監(jiān)測地點為：超凈臺桌面、 超凈臺內(nèi)槍（包括槍吸孔內(nèi)和槍體）、超凈臺槍頭盒、超凈臺內(nèi)常用 PE管架及PCR管架，冰 箱冰柜把手（兩臺） 、冰箱內(nèi)部（每個冰箱 3 個棉簽包括冰箱內(nèi)部表面和隨機的冰箱內(nèi)試劑 盒）、常用試劑試劑盒、試劑表面。抽提桌面、抽提區(qū)槍（包括槍吸孔和槍體）、抽提區(qū)常用B:物流： 嚴(yán)格單向物流，只允許從 測區(qū)）的物品流動。 B 的 84 消毒液浸泡半小時）試管架、抽提區(qū)槍頭盒、水浴鍋水、沸水浴鍋水，相關(guān)試驗人員辦公室桌面、鼠標(biāo)、鍵盤。 需要做

10、的工作:安排指定人員每月進(jìn)行一次監(jiān)測。每次監(jiān)測填寫記錄表（見附表）A區(qū)（樣品制備及 PCR加樣區(qū)）至U B區(qū)（PCF擴增及雜交檢區(qū)任何物品（PCR管架、PE管架）進(jìn)入A區(qū)前必須經(jīng)過處理（1:100 ） 。各區(qū)物品單獨使用，不允許交叉使用。需要做的工作： A物品A-B前處理（84浸泡后洗滌）C:人流：抽提、PCR以及B區(qū)必須要有單獨的實驗服，進(jìn)入A B兩區(qū)進(jìn)行實驗必須穿上各自的實驗服，不允許將實驗服穿至另一個區(qū)。 （注:如果進(jìn)入一個區(qū)不是為了實驗，可以不 穿實驗服，但絕對不允許穿另一個區(qū)的實驗服進(jìn)入） 。實驗服兩周洗滌一次，但切記兩個區(qū) 的衣服不要在同一批洗，分成兩次洗，可以這周洗滌這個區(qū)的下周

11、洗滌另一個區(qū)的。需要做的工作:指定一周輪一周洗滌衣服，各人衣服各人負(fù)責(zé)。D:實驗規(guī)程：1、實驗時必須戴橡膠手套或薄膜手套；抽提桌面實驗完成后用84擦洗；PCR槍體和吸樣孔內(nèi)）1： 25 的 84 消毒液擦洗。冰箱把手及外表每周用 1： 25 水浴鍋及沸水浴鍋每周換一次水。相關(guān)工作人員辦公桌每周用1 ： 25 的實驗室每天 （實驗量少的話可減少） 晚上用紫外照射；如果在實驗過程中發(fā)現(xiàn)有樣品（包括 抽提前和抽提后）或 PCR產(chǎn)物必須立即用84擦洗；在B區(qū)如果手接觸過桌面或者其它有可 能污染有PCR產(chǎn)物的地方（槍、Luminex儀器等）必須盡快洗手；定期處理：各區(qū)槍每周用 1： 25 的 84 消毒

12、液擦洗（不需要拆開，主要是槍體和吸樣孔內(nèi)） 。各區(qū)試管架每周用 1： 25 的 84 消毒液擦洗。各桌面每周用 的 84 消毒液擦洗。實驗（特別是雜交檢測） ，發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)物濺出立即擦洗。 勤洗手。PCR安排指定人員每周擦洗指定位置。PCR實驗室做完實驗打開紫外。A、B、C、D、E、84 消毒液擦洗 需要做的工作：E: PCR產(chǎn)物處理： 鮮袋扎好后再丟棄； 律扎好后丟棄；電泳旁邊的冰箱為 個月 ） 清理。需要做的工作：B準(zhǔn)備保鮮袋，每次的PCR產(chǎn)物（包括雜交產(chǎn)物和 PCR產(chǎn)物）丟棄前必須用保 雜交檢測試驗區(qū)準(zhǔn)備可以裝保鮮袋并有蓋子的垃圾桶，使用過的槍頭一PCR產(chǎn)物臨時存放區(qū)，嚴(yán)禁 PCR產(chǎn)物開蓋存

13、放，定期（一F: 發(fā)生污染后的處理: 份。找至污染源后，桌面用 照射過夜，槍頭盒、試管架 用 84 浸泡后洗滌干凈。 冰箱把手A:嚴(yán)格操作，把 PCR產(chǎn)物作為高危險物品小心處理。 :指定日期清理 PCR產(chǎn)物。如果懷疑有污染發(fā)生， 執(zhí)行監(jiān)測程序， 對于重點懷疑對象可以多作幾84擦洗后紫外照射一個晚上，槍一用84擦洗（拆開）后紫外84 擦洗后紫外照射過夜，槍頭丟棄，試劑丟棄，衣物84 擦洗后紫外照射過夜。 冰箱內(nèi)部 84 擦洗如果污染嚴(yán) 重的話流水沖洗后 84擦洗，試劑盒 84 擦洗或流水沖洗。處理完后執(zhí)行監(jiān)測程序檢查污染 情況。PCR污染情況監(jiān)測表序號編號地點試驗結(jié)杲備注1超凈臺桌面2超凈臺槍槍吸孔內(nèi)和槍體3超凈臺槍頭盒4超凈臺內(nèi)EP管架及PCR管架5冰箱把手6冰柜把手7冰箱內(nèi)部18冰箱內(nèi)部29冰箱常用試劑試劑盒10冰柜內(nèi)部111冰柜內(nèi)部112冰柜常用試劑試劑盒13PCR試劑表面14抽提桌面15抽提區(qū)槍包括槍吸孔和槍體16抽提區(qū)常用試管架17抽提區(qū)槍頭盒18水浴鍋水19沸水浴鍋水20試驗人員1辦公室桌面21試驗人員1鼠標(biāo)、鍵盤22試驗人員2辦公室桌面23試驗人員2鼠標(biāo)、鍵盤24試驗人員3辦公室桌面25試驗人員3鼠標(biāo)、鍵盤26試驗人員4辦公室桌面27試驗人員4鼠標(biāo)、鍵盤28試驗人員5辦公室桌面29試驗人員5鼠標(biāo)、鍵盤30陽性對照31陰性對照試驗日期試驗人員試驗方法：準(zhǔn)