第二章發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離方法課件

1、第二章 發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，提高固液分離效率；盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中(多為液相)；去除發(fā)酵液中部分雜質(zhì)，以利于提取和精制后續(xù)各工序的順利進(jìn)行。 發(fā)酵液預(yù)處理的目的2.1 發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離預(yù)處理和固液分離內(nèi)容生物產(chǎn)品的分類（根據(jù)分離特點(diǎn)）培養(yǎng)液產(chǎn)品：如飲料酒類，沒有提取與精制，只需考慮除去固相雜志即可。細(xì)胞產(chǎn)品：如活性干酵母，只需固液分離和洗滌可溶性雜志的過程。粗制產(chǎn)品：如工業(yè)用酶制劑，只需考慮產(chǎn)品提取。精制產(chǎn)品：有純度要求，大多數(shù)生物產(chǎn)品屬此類，其分離回收過程一般包括預(yù)處理和固液分離、提取、精制和成品加工四步。精制產(chǎn)品分離純化一般流程胞外產(chǎn)品胞內(nèi)

2、產(chǎn)品2.1 發(fā)酵液預(yù)處理2.1.1 引言發(fā)酵液預(yù)處理的目的：改變?yōu)V液的性質(zhì)除去部分可溶性雜質(zhì)盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的一相中（多數(shù)是液相）以利于后續(xù)各工序的順利進(jìn)行預(yù)處理的方法加水稀釋法Dilution with water加熱法 Heating調(diào)節(jié)懸浮液的pH值 Regulation of pH凝聚和絮凝 Coagulation and flocculation助濾劑Filter aids和反應(yīng)劑 Reactant高價無機(jī)離子的去除 Removal of inorganic ion雜蛋白的去除 Removal of USELESS PROTEIN2.1.2發(fā)酵液過濾性能的改變生物懸浮液的特

3、性：懸浮物顆粒小，比重與液相相差不大；固體粒子可壓縮性大；粘度大，含有蛋白質(zhì)、多糖等膠體物質(zhì)，大多為非牛頓型流體。改性的目的：降低濾餅比阻，提高過濾與分離的速率。 發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，而且懸浮液中大部分是水； 懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大； 固體粒子可壓縮性大； 液相粘度大，大多為非牛頓型流體； 性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時間變化。微生物發(fā)酵液的特性一、降低液體粘度根據(jù)流體力學(xué)原理，濾液通過濾餅的速率與液體的粘度成反比，降低液體粘度就可有效提高過濾速率。降低液體粘度的常用方法 加水稀釋法 加熱法 加水稀釋法 優(yōu)點(diǎn)：降低液體粘度，提高過濾速率缺點(diǎn)：增加懸浮液的體積，加大后繼過程的處理任務(wù)。 加熱法 優(yōu)

4、點(diǎn)：1. 升高溫度可有效降低液體粘度，提高過濾速率； 2. 在適當(dāng)溫度和受熱時間下可使蛋白質(zhì)凝聚，形成較大顆粒的凝聚物，進(jìn)一步改善了發(fā)酵液的過濾特性。 實(shí)例：鏈霉素發(fā)酵液，調(diào)酸至pH3.0后，加熱至70，維持半小時，液相粘度下降至原來的1/6，過濾速率可增大10100倍。 加熱法注意事項(xiàng)： 使用加熱法時必須嚴(yán)格控制加熱溫度與時間。加熱的溫度必須控制在不影響目的產(chǎn)物活性變質(zhì)的范圍內(nèi)；溫度過高或時間過長，會使細(xì)胞溶解，胞內(nèi)物質(zhì)外溢，增加發(fā)酵液的復(fù)雜性，影響其后的產(chǎn)物分離與純化。二、調(diào)整pHpH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。是發(fā)酵工業(yè)中發(fā)酵液預(yù)處理中常

5、用的方法之一。氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)，在其等電點(diǎn)處的溶解度最小，此即為等電點(diǎn)沉淀法。應(yīng)用實(shí)例：味精生產(chǎn)中，利用等電點(diǎn)(pH3.22)沉淀法提取谷氨酸；對于蛋白質(zhì)，由于羧基的電離度比氨基大，故蛋白質(zhì)的酸性性質(zhì)通常強(qiáng)于堿性，因而大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在酸性范圍內(nèi)(pH 4.05.5)。利用酸性來調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值使之達(dá)到等電點(diǎn)，可除去蛋白質(zhì)等酸性兩性物質(zhì)。 在膜過濾中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，通過調(diào)整pH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即可減少堵塞和污染。細(xì)胞、細(xì)胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在某個pH值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾的進(jìn)行。 應(yīng)用實(shí)例：三、凝聚與絮凝 采用凝聚和絮凝技

6、術(shù)能有效改變大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)，使其聚結(jié)成較大的顆粒，便于提高過濾速率； 采用凝聚和絮凝技術(shù)能有效地除去雜蛋白質(zhì)和固體雜質(zhì)，提高濾液質(zhì)量。 作用：1凝聚 凝聚是指在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。 在生理pH值下，發(fā)酵液中的菌體或蛋白質(zhì)常常帶有負(fù)電荷，由于靜電引力的作用，使溶液中帶相反電荷的陽離子被吸附在其周圍，在界面上形成雙電層。但是，這些正離子還具有因熱運(yùn)動而離開膠粒表面的趨勢。在相距膠核表面約一個離子半徑Stern平面以內(nèi)，正離子被緊密束縛在膠核表面，稱為吸附層；在Stern平面以外，剩余的正離子在溶液中擴(kuò)散開去，距離越遠(yuǎn)，濃度越小，

7、最后達(dá)到主體溶液的平均濃度，稱為擴(kuò)散層。雙電層的組成當(dāng)膠粒在溶液中作相對運(yùn)動時，總有一薄層液體，隨著它一起滑移，這一薄層的厚度比吸附層稍大，滑移面在圖中用波紋線表示。滑移面上的電位稱為電位（或電動電位），它是控制膠粒間電排斥作用的電位，用來表征雙電層的特征，是研究凝聚機(jī)理的重要參數(shù)。 帶有相同電荷和擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)。電位越大，電排斥作用就越強(qiáng)，膠粒的分散程度也越大，發(fā)酵液過濾就越困難。 膠粒保持分散狀態(tài)的原因 膠粒表面的水化作用，形成了包圍于粒子周圍的水化層，也能阻礙膠粒間的直接聚集。如果在發(fā)酵液中加入具有相反電性的電解質(zhì)，就可以中和膠粒的電性，使電位降低，膠體體系變得不穩(wěn)定。當(dāng)雙電層的排斥力

8、不足以抗衡膠粒間的范德華引力時，由于熱運(yùn)動的結(jié)果就導(dǎo)致膠粒的互相碰撞而聚集。另外，由于電解質(zhì)離子在水中的水化作用會破壞膠粒周圍的水化層，使膠?？梢灾苯优鲎捕奂?。影響凝聚作用的主要因素是無機(jī)鹽的種類、化合價以及無機(jī)鹽的用量。根據(jù)靜電學(xué)基本定理，可推導(dǎo)電位的基本公式為 （21）q：膠體的電動電荷密度，即滑移面上的電荷密度，庫侖/m2；D：水的介電常數(shù)，F(xiàn)m-1；：擴(kuò)散層的有效厚度，m（即吸附層和擴(kuò)散層界面處電位d降低到其值為1/e處的距離，不能直接測定） （2-2)N：阿伏伽德羅常數(shù)，mol-1；e：電子電荷，庫侖；k：波爾茲曼常數(shù)，JK-1；T：熱力學(xué)溫度，K；ci：i離子摩爾濃度，mol/L

9、；Zi：i離子的化合價。從上兩式可知，電位與溶液中帶相反電荷的離子強(qiáng)度有關(guān)，因此，提高離子的化合價和濃度可以壓縮擴(kuò)散雙電層，使其厚度減小，從而使電位降低。電解質(zhì)的凝聚能力可用凝聚值來表示，使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度（mol/L）稱為凝聚值。根據(jù)Schuze-Hardy法則，反離子的價數(shù)越高，該值就越小，即凝聚能力越強(qiáng)。陽離子對帶負(fù)電荷的發(fā)酵液膠體粒子凝聚能力的次序?yàn)椋篈l3+ Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Li+。 常用的凝聚電解質(zhì)有：硫酸鋁A12(SO4)318H2O (明礬)氯化鋁AICl36H2O三氯化鐵FeCl36H2O硫酸亞鐵FeSO47H2O石灰、ZnS

10、O4、MgCO3等。 2絮凝采用凝聚方法得到的凝聚體，其顆粒常常是比較細(xì)小的，有時還不能有效地進(jìn)行分離。采用絮凝法則常可形成粗大的絮凝體，使發(fā)酵液較易分離。絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成較大絮凝團(tuán)的過程。 絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，它們具有長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性功能團(tuán)，包括帶電荷的陰離子(如-COOH)或陽離子(如-NH2)基團(tuán)以及不帶電荷的非離子型基團(tuán)。它們通過靜電引力、范德華力或氫鍵的作用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面。當(dāng)一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)接時，就形成了較大的絮團(tuán)，

11、這就是絮凝作用。對絮凝劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)一般有下列要求:分子必須含有相當(dāng)多的活性官能團(tuán)，使之能和膠粒表面相結(jié)合；必須具有長鏈的線性結(jié)構(gòu)，以便同時與多個膠粒吸附形成較大的絮團(tuán)，但絮凝劑的相對分子量不能超過一定限度，以使其具有良好的溶解性。 根據(jù)其活性基團(tuán)在水中解離情況的不同，絮凝劑可分為: 非離子型 陰離子型 陽離子型 根據(jù)其來源的不同又可分為如下三類：(1) 有機(jī)高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物。(2) 無機(jī)高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等。(3) 天然有機(jī)高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。 應(yīng)用現(xiàn)狀：目前最常用的絮凝劑是有機(jī)合成的聚

12、丙烯酰胺類衍生物，其絮凝體粗大，分離效果好，絮凝速度快，用量少，適用范圍廣。它們的主要缺點(diǎn)是存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，一般不宜用于食品及醫(yī)藥工業(yè)。近年來發(fā)展的聚丙烯酸類陰離子絮凝劑，無毒，可用于食品和醫(yī)藥工業(yè)。 影響因素：較多的絮凝劑有助于增加橋架的數(shù)量，但過多的添加量反而會引起吸附飽和，絮凝劑爭奪膠粒而使絮凝團(tuán)的粒徑變小，絮凝效果下降。 絮凝劑的加量絮凝劑相對分子量和類型溶液的pH攪拌轉(zhuǎn)速和時間溶液pH值的變化常會影響離子型絮凝劑中官能團(tuán)的電離度，從而影響吸附作用的強(qiáng)弱。3混凝對于帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙

13、重機(jī)理。這種包括凝聚和絮凝機(jī)理的過程，稱為混凝。對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，則可以與無機(jī)電解質(zhì)凝聚劑搭配使用。首先加入電解質(zhì)，使懸浮粒子間的雙電層電位降低、脫穩(wěn)，凝聚成微粒，然后再加入絮凝劑絮凝成較大的顆粒。無機(jī)電解質(zhì)的凝聚作用為高分子絮凝劑的架橋創(chuàng)造了良好的條件，從而大大提高了絮凝的效果。四、加入惰性助濾劑助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。 使用助濾劑后，懸浮液中大量的細(xì)微膠體粒子被吸附到助濾劑的表面上，從而改變了濾餅結(jié)構(gòu)，它的可壓縮性下降，過濾阻力降低。 硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠巖、白土、炭粒、淀粉常用的助濾劑助濾劑的使用方法：在過濾介質(zhì)表面預(yù)涂助濾劑直

14、接加入發(fā)酵液兩種方法同時兼用使用時需要一個帶攪拌器的混合槽，充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆颍乐狗謱映恋?。五、加入反?yīng)劑 加入某些不影響目的產(chǎn)物的反應(yīng)劑，可消除發(fā)酵液中某些雜質(zhì)對過濾的影響，從而提高過濾速率。 加入反應(yīng)劑，可以和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀，如CaSO4、AlPO4等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，并且能使膠狀物和懸浮物凝固，從而改善過濾性能。正確選擇反應(yīng)劑和反應(yīng)條件，能使過濾速率提高310倍。應(yīng)用實(shí)例：在新生霉素發(fā)酵液中加入氯化鈣和磷酸鈉，生成的磷酸鈣沉淀可充當(dāng)助濾劑，另一方面可使某些蛋白質(zhì)凝固。環(huán)絲氨酸發(fā)酵液用氧化鈣和磷酸處理，生成磷酸鈣沉

15、淀，能使懸浮物凝固，多余的磷酸根離子還能除去鈣、鎂離子，并且在發(fā)酵液中不會引入其他陽離子，以免影響環(huán)絲氨酸的離子交換吸附。如果發(fā)酵液中含有不溶性多糖物質(zhì)，則最好用酶將它轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過濾速率。例如萬古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，發(fā)酵液過濾前加入0.025的淀粉酶，攪拌30min后，再加2.5硅藻土助濾劑，從而可使過濾速率提高5倍。2.2 發(fā)酵液中部分雜質(zhì)的去除在預(yù)處理時，必須采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ惯@些雜質(zhì)沉淀，在固液分離時除去，以利于后提取與精制過程的順利進(jìn)行。 一、高價無機(jī)離子的除去 發(fā)酵液中常見的無機(jī)離子主要有Ca2+、Mg2+和Fe2+等。 通常使用草酸 當(dāng)發(fā)酵液中鈣離子濃度較高時，可用草酸的可溶

16、性鹽，如草酸鈉。反應(yīng)生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固，改善發(fā)酵液的過濾性能。由于草酸價格較貴，應(yīng)注意采用適當(dāng)方法回收。 鈣離子的去除：Ca2+加草酸鈉沉淀 C2O4Na2+ Ca2 + C2O4Ca+ 2Na+應(yīng)用實(shí)例：四環(huán)類抗生素發(fā)酵液常采用草酸鈣沉淀法除去鈣離子，在其廢液中加入硫酸鉛，在60下反應(yīng)生成草酸鉛，后者在9095下用硫酸分解，再經(jīng)過濾、冷卻、結(jié)晶后即可回收草酸。 鎂離子的去除： 可加入三聚磷酸鈉，它和鎂離子形成可溶性絡(luò)合物后，即可消除對離子交換的影響。 Na5P3O10 + Mg2+ MgNa3P3O10 + 2Na+加入黃血鹽(三水合六氰合鐵()酸鉀 )，可與鐵離子形成普魯士藍(lán)沉

17、淀而除去。 發(fā)酵液中鐵離子的去除：4Fe3+ 3K4Fe(CN)6Fe4Fe(CN)63+ 12K+二、雜蛋白質(zhì)的除去在改善發(fā)酵液過濾特性的眾多方法中，有許多可在改善過濾特性的同時，除去雜蛋白質(zhì)。 1. 沉淀法 蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，在酸性溶液中，能與一些陰離子如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，能與一些陽離子如Ag、Cu2、Zn2、Fe3和Pb2等形成沉淀。 2. 變性法 使蛋白質(zhì)變性的方法很多，其中最常用的是加熱法。加熱不僅使蛋白質(zhì)變性，同時降低液體粘度，提高過濾速率。 將檸檬酸發(fā)酵液加熱至80以上，使蛋白質(zhì)變性凝固和降低發(fā)酵液粘度，即可大大提高

18、過濾速率。 使蛋白質(zhì)變性的其他方法有：大幅度調(diào)節(jié)pH，加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑等。 變性法存在一定的局限性。加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH也會導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，并且要消耗大量酸堿；有機(jī)溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。3. 吸附法 加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。 在四環(huán)類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)，在生產(chǎn)實(shí)際中已取得很好的效果。在枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，從而可加快過濾速率。應(yīng)用實(shí)例：2.3 固液分離

19、過程和分類 固液分離是生物產(chǎn)品工廠中經(jīng)常遇到的重要單元操作。培養(yǎng)基、發(fā)酵液、某些中間產(chǎn)物和半成品等都需進(jìn)行固液分離。 其中發(fā)酵液由于種類多、粘度大和成分復(fù)雜，其固液分離最為困難。固液分離的方法很多，根據(jù)顆粒收集的方式不同，可分為兩大類型：第一類：沉降和浮選 第二類：過濾在沉降和浮選所組成的第一類中，液體受限于一個固定的或旋轉(zhuǎn)的容器而顆粒在液體里自由移動，分離是由于內(nèi)、外力場的加速作用產(chǎn)生的質(zhì)量力施加在顆粒上造成的，這種力場可能是重力場、離心力場或磁場。 如果作用的是重力或離心力(除浮選外)，為了進(jìn)行分離，在固體和懸浮液體之間必須要有密度差。 第二類被不嚴(yán)格地統(tǒng)稱為過濾，顆粒受到過濾介質(zhì)的限制，

20、而液體可自由通過介質(zhì)。 在發(fā)酵液或生物培養(yǎng)液的分離過程中，當(dāng)前用得較多的還是過濾(包括錯流膜過濾)和離心兩大方法。2.4 過濾法（Filtration）過濾是傳統(tǒng)的化工單元操作，而且是目前工業(yè)生產(chǎn)中用于分離細(xì)胞和不溶性物質(zhì)的主要方法，其操作是迫使液體通過固體支承物或過濾介質(zhì)，把固體截留，從而達(dá)到固、液分離的目的。過濾過濾介質(zhì)：過濾采用的多孔物質(zhì)；濾漿：所處理的懸浮液；濾液：通過多孔通道的液體；濾餅或?yàn)V渣：被截留的固體物質(zhì)一發(fā)酵液的過濾特性和濾餅的重量比阻微生物的發(fā)酵液大多數(shù)屬于非牛頓型液體，濾渣為可壓縮性的。衡量過濾特性的主要指標(biāo)是濾餅的重量比阻rB，它表示單位濾餅厚度的阻力系數(shù)，與濾餅的結(jié)構(gòu)

21、特性有關(guān)。對于不可壓縮性濾餅，比阻值為常數(shù)，但對于可壓縮性濾餅，比阻rB是操作壓力差的函數(shù)，一般可用下式表示： rBr (p)m (2-3) r為不可壓縮濾渣的比阻，對于一定的料液，其值為常數(shù)； m為壓縮性指數(shù)，一般取0.50.8，對不可壓縮性濾餅，m0；由（23）式可知，濾餅的比阻值是隨操作壓力差的提高而增大的。開始過濾時應(yīng)注意不能很快提高壓差，通?？恳褐淖匀粔翰钸M(jìn)料，并應(yīng)緩慢地，逐步地升高壓力，一般在相當(dāng)長的時間內(nèi)，壓力差不要超過0.05 MPa，最后的壓差也不超過0.30.4 MPa。恒壓下，可壓縮性濾餅的比阻值應(yīng)為常數(shù)。如過濾介質(zhì)的阻力相對較小可以忽略不計(jì)，則恒壓下的過濾方程式如下：

22、q2 （24） 式中 q 到瞬間通過單位過濾面積的濾液量，m； p 壓力差，Pa； 濾液粘度，Pas；rB 濾餅的重量比阻，m/kg；XB通過單位體積濾液，所形成的濾渣重量（干重），kg/m3； 過濾時間，s。 重量比阻可根據(jù)式（24），利用圖解法求得。以/q為縱軸，以q為橫軸所得的直線斜率為M，則rB可按下式計(jì)算： rB （25）根據(jù)濾餅的重量比阻值，可衡量各種不同發(fā)酵液過濾的難易程度。 練習(xí)題： 在從慶大霉素發(fā)酵液過濾分離鏈霉菌的過濾實(shí)驗(yàn)中，使用硅藻土作助濾劑。小型過濾機(jī)的過濾面積A0.01m3，濾液粘度1.110-3 Pas，過濾壓差p6.772104 Pa，且發(fā)酵液固體懸浮物濃度為15

23、kg/m3。過濾時間所對應(yīng)的濾液量如下： /s5102030V10-6/m340558095求：濾餅比阻rB。 二影響過濾速度的因素 過濾速度和菌種、發(fā)酵條件（培養(yǎng)基的組成，未用完培養(yǎng)基的數(shù)量，消泡劑，發(fā)酵周期）等有關(guān)。1. 菌種對過濾速度影響： 真菌的菌絲比較粗大，發(fā)酵液容易過濾，常不需特殊處理。放線菌發(fā)酵液菌絲細(xì)而分枝，交織成網(wǎng)絡(luò)狀。還含有很多多糖類物質(zhì)，粘性強(qiáng)，過濾較困難，一般需經(jīng)預(yù)處理，以凝固蛋白質(zhì)等膠體。細(xì)菌發(fā)酵液的菌體更細(xì)小，過濾十分困難，如不用絮凝等方法預(yù)處理發(fā)酵液，往往難以采用常規(guī)過濾的設(shè)備來完成過濾操作。 用黃豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源會使過濾困難。發(fā)酵后期加消泡劑或剩余

24、大量未用完的培養(yǎng)基，都會使過濾困難。2. 培養(yǎng)基的組成對過濾速度的影響在菌絲自溶前必須放罐，因?yàn)榧?xì)胞自溶后的分解產(chǎn)物一般很難過濾。延長發(fā)酵周期雖能使發(fā)酵單位有所提高，但嚴(yán)重影響發(fā)酵液質(zhì)量，使色素和膠狀雜質(zhì)增多、過濾困難，最終造成成品質(zhì)量降低。3. 發(fā)酵終了時間對過濾的影響三過濾設(shè)備生化工業(yè)常用的過濾設(shè)備主要有加壓葉濾機(jī)、板框過濾機(jī)和回轉(zhuǎn)真空過濾機(jī)等。 四錯流過濾（Cross-Flow Filtration）錯流過濾又稱切向流過濾，是一種維持恒壓下高速過濾的技術(shù)。發(fā)酵液在過濾介質(zhì)表面作切向流動，利用流動的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體（濾餅）移走。 錯流過濾在膜分離過程中被廣泛使用，隨著過濾介質(zhì)的

25、不斷改進(jìn)，采用精密微濾膜的錯流過濾法已逐漸成為過濾操作的主流。與傳統(tǒng)的真空過濾或板框過濾相比，錯流膜過濾用于抗生素生產(chǎn)的過濾工序具有如下優(yōu)點(diǎn)： 過濾收率高。 濾液質(zhì)量好。 減少處理步驟。 對染菌罐批易于處理，也容易進(jìn)行擴(kuò)大生產(chǎn)。錯流過濾的缺點(diǎn)：錯流過濾產(chǎn)生的剪切作用容易使蛋白質(zhì)產(chǎn)物失活； 能耗比一般過濾高，大部分用來使流體產(chǎn)生快速流動； 固相的含水量較高，主要是起濃縮作用； 不能避免過濾介質(zhì)的污染和堵塞，解決的辦法是采用脈沖反洗式錯流過濾。 五 澄清過濾當(dāng)懸浮液通過濾層時，固體顆粒被阻攔或吸附在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清，這種方法叫做澄清過濾。適合于固體含量少于0.1%(V)、顆粒直徑較小的

26、懸浮液的過濾分離，多用于需要除菌的場合。2.5 離心分離法（Centrifugation）離心分離，是利用慣性離心力和物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的不同而進(jìn)行的分離操作。 離心分離對那些固體顆粒很小或液體黏度很大，過濾速度很慢，甚至難以過濾的懸浮液十分有效；對那些忌用助濾劑或助濾劑使用無效的懸浮液的分離，也能得到滿意的結(jié)果。分離速率快、分離效率高、液相澄清度好等。 優(yōu)點(diǎn)： 離心分離結(jié)果得到的是漿狀物而不是干的濾餅； 離心設(shè)備復(fù)雜、價格昂貴。 缺點(diǎn)：離心分離的形式 離心沉降，利用固液兩相的相對密度差，在離心機(jī)無孔轉(zhuǎn)鼓或管子中進(jìn)行懸浮液的分離操作；離心過濾，利用離心力并通過過濾介質(zhì)，在有孔轉(zhuǎn)鼓離心機(jī)中

27、分離懸浮液的操作；離心分離和超離心，利用不同溶質(zhì)顆粒在液體中各部分分布的差異，分離不同相對密度液體的操作。 2.5.1 離心沉降 一離心沉降的原理 離心沉降的基礎(chǔ)是固體的沉降。Ff球形顆粒沉降的受力情況當(dāng)一個固體微粒通過無限連續(xù)流體時，其運(yùn)動速度受到兩種力影響：一是連續(xù)流體對它的浮力FB；二是流體對運(yùn)動粒子的粘滯力Ff。當(dāng)這兩種力達(dá)到平衡時，該微粒即以恒定的速度沉降。 假設(shè)該微粒為球形，則該微粒所受的浮力可表示為： FB = (s - )gV = (2-6) 式中 d為粒子直徑； s和分別為粒子和流體的密度； g為重力加速度； V為粒子體積。在稀溶液中，作用于單個球形微粒上的粘滯力Ff，可用S

28、tockes定律表示：Ff = = （2-7） 式中連續(xù)流體的黏度；u為粒子的運(yùn)動速度；CD為阻滯系數(shù)；A為粒子在運(yùn)動方向上的投影面積。 其中CD不是常數(shù)，它取決于雷諾數(shù)Re的變化，對于球形粒子，根據(jù)實(shí)驗(yàn)得知： Re 1 CD = 24/Re (2-8)1 Re 104 CD = 24/Re + 3/ + 0.34 (2-9) 對于生化溶質(zhì)來說，可以滿足Re1的要求，所以：Ff = CD = (2-10)當(dāng)粒子以勻速運(yùn)動沉降時，F(xiàn)BFf，故最終勻速沉降速率為： u = (2-11) 沉降速率與粒子直徑的平方成正比，與粒子和流體的密度差成正比，而與流體的黏度成反比；也就是說粒子的沉降速度僅僅是液

29、體性質(zhì)及粒子本身特性的函數(shù)。 如果粒子在離心力場中沉降，則重力加速度g應(yīng)換成離心加速度2r，即： u = （2-12） 為旋轉(zhuǎn)角速度， r為粒子離轉(zhuǎn)軸中心的距離。 離心分離因數(shù)Fr (又稱離心力強(qiáng)度) Fr = （2-13） Fr表示了粒子在離心機(jī)中產(chǎn)生的離心加速度與自由下降的加速度之比；Fr越大，越有利于分離。 在實(shí)踐中，常按分離因數(shù)Fr的大小，對離心機(jī)分類：Fr3000，為常速離心機(jī)；Fr300050000，為中速離心機(jī)；Fr50000，為高速離心機(jī)；Fr = 2104106，為超速離心機(jī) 二離心式沉降分離設(shè)備及其原理利用離心沉降力將懸浮液中固液相分離，其設(shè)備可分為兩大類：離心沉降設(shè)備離心

30、過濾設(shè)備 離心沉降設(shè)備從操作方式上看，有分批操作和連續(xù)操作之分；從形式上看有管式、套筒式、碟片式等形式；從出渣方式上看，有人工間歇出渣和自動出渣等方式。1管式離心機(jī)管式離心機(jī)結(jié)構(gòu)簡單，僅是一根直管形的轉(zhuǎn)筒，其直徑較小，長度較大，轉(zhuǎn)速很高，可達(dá)到50000rpm，從而產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，除此之外它還可以冷卻，這有利于蛋白質(zhì)的分離。 操作時，懸浮液或乳濁液從管底加入，被轉(zhuǎn)筒的縱向肋板帶動與轉(zhuǎn)筒同速旋轉(zhuǎn)，上清液在頂部排出，固體粒子沉降到筒壁上形成沉渣和粘稠的漿狀物。 缺點(diǎn)是運(yùn)轉(zhuǎn)一段時間后，需停機(jī)清除沉渣后才能重新使用，因此操作是間歇式的。 假設(shè)某典型粒子位于距離心機(jī)底部z及離轉(zhuǎn)軸r處的位置上，這一位置

31、是在液體表面半徑R1和離心管半徑R0之間。 粒子在運(yùn)轉(zhuǎn)的離心機(jī)中沿著z和r兩個方向運(yùn)動，其中在z方向上的運(yùn)動，是由離心機(jī)底部進(jìn)入料液的對流作用引起的： = （2-14）式中Q為料液流量。z方向上的運(yùn)動速度隨Q的增加而加大，而與粒子所處位置無關(guān)，因此它是常數(shù)。 粒子在r方向上的運(yùn)動，可用下式表示： = （2-15） 又知粒子在重力場中的沉降速率為： ug = （2-16） 由式（2-15）和（2-16）可得： = （2-17） 結(jié)合式（2-14）、（2-17），可得到微粒在離心機(jī)中的運(yùn)動軌跡，即： = = （2-18）當(dāng)ug較高（微粒直徑或其密度較大）時，微粒將很快到達(dá)管壁；而當(dāng)泵入流速Q(mào)增大時

32、，懸浮固體微粒將向上走得更遠(yuǎn)才能到達(dá)管壁。 考慮到最難除去的粒子，即在rR1處進(jìn)入離心機(jī)，并且在出口處（zH）接近筒壁(rR0)的粒子。對這些難以去除的粒子，按進(jìn)入和離開的邊界條件將式（2-18）進(jìn)行積分得： Q = （2-19）對于管式離心機(jī)，正常分離操作所允許的最大物料流速，即生產(chǎn)能力Q，是反映微粒和料液特性的沉降速度ug以及離心機(jī)特性參數(shù)H、R0、R1及的函數(shù)。 在大多數(shù)管式離心機(jī)中，由于液層很薄，所以R0接近于R1，因此式（2-19）可以簡化為：式中R（R0R1）/2，為平均半徑，這樣式（219）可以寫成：該式同樣表明最大流量Q取決于系統(tǒng)的性質(zhì)ug和離心機(jī)的特性，這給離心機(jī)的設(shè)計(jì)、放大

33、以及操作帶來了方便。 用管式離心機(jī)從發(fā)酵液中分離大腸桿菌細(xì)胞，已知離心機(jī)轉(zhuǎn)鼓內(nèi)徑為0.127m，高0.73m。轉(zhuǎn)速為16000rpm，生產(chǎn)能力Q0.2m3/h。求：（1）細(xì)胞的離心沉降速度ug；（2）若大腸桿菌細(xì)胞破碎后，微粒直徑平均降低一倍，細(xì)胞漿液濃度升高3倍。試估算用上述離心機(jī)對破碎細(xì)胞液的處理能力。2碟片式離心機(jī) 碟片式離心機(jī)有一密封的轉(zhuǎn)鼓，內(nèi)裝十至上百個錐頂角為60100錐形碟片，懸浮液由中心進(jìn)料管進(jìn)入轉(zhuǎn)鼓，從碟片外緣進(jìn)入碟片間隙向碟片內(nèi)緣流動。顆粒沉降到碟片內(nèi)表面上后向碟片外緣滑動，最后沉積到鼓壁上。已澄清的液體經(jīng)溢流口或由向心泵排出。在碟片式離心機(jī)中，料液從中心管進(jìn)入離心機(jī)底部后

34、，以角沿著錐形碟片向上、向內(nèi)運(yùn)動?，F(xiàn)設(shè)典型粒子位于直角坐標(biāo)的某點(diǎn)(x，y)上，這里的x是指沿著碟片的粒子離開碟片外緣的距離；而y是指離開碟片的垂直距離。碟片外緣與內(nèi)緣半徑分別為R0和R1，轉(zhuǎn)速為。 粒子的運(yùn)動過程可分析如下： (1) 粒子在x方向的運(yùn)動由對流和沉降引起，可用下式表示： = （2-20） 式中u0是因?qū)α髟斐傻囊核?，usin是粒子在離心力作用下產(chǎn)生的x方向上的沉降分速度，是碟片與垂線間的傾角。 式中Q為總流量；n為碟片數(shù)；r為粒子離轉(zhuǎn)鼓軸線的距離；h為碟片間的垂直距離；f（y）為流速隨碟片間的距離變化的函數(shù)。 大多數(shù)情況下，u0 比沉降速度usin大得多，并且u0是半徑和y的函數(shù)

35、，在碟片表面上，其值為零，在碟片間隙的中央其值最大。因此，可以得到下式： = = （2-21） 根據(jù)質(zhì)量守恒定律，可知在y方向上u0的平均值必然與該平均速度相等： = （2-22） 根據(jù)定義，函數(shù)f（y）在碟片間隙h上的積分應(yīng)為： = 1 (2-23) 將式（2-20）、（2-21）結(jié)合，就得到粒子在x方向上運(yùn)動情況： = u0 = （2-24）(2) 粒子沿y方向上的運(yùn)動速度： = （2-25）或?qū)懗桑?= 將上式與式(2-24)結(jié)合，可得下式： = = （2-26） 從示意圖可發(fā)現(xiàn)r = R0- xsin，將它代入式(2-24)，可得到粒子在離心機(jī)碟片間的運(yùn)動軌跡： = （2-27） 從示

36、意圖中不難看出，處于碟片外緣半徑即x = 0處且在相鄰兩碟片中的下碟片上，即y = 0處的粒子是最難分離的。如果在其離開隙道前剛好抵達(dá)上碟片底部，及其坐標(biāo)為x = ，y = h，則在離心立場的作用下，該粒子將沿著碟片的底部運(yùn)動到碟片的外緣，匯集到濾渣中去。 按照上述分析的邊界條件，對式(2-27)進(jìn)行積分并整理后可得：Q = = （2-28）與管式離心機(jī)一致，碟片式離心機(jī)的生產(chǎn)能力Q取決于參數(shù)ug和，其中，ug是由懸浮固體微粒的特性決定的；而反映了離心機(jī)的幾何特性。 2.5.2 離心過濾離心過濾是將料液送入有孔的轉(zhuǎn)鼓并利用離心力場進(jìn)行過濾的過程，以離心力為推動力完成過濾作業(yè)，兼有離心和過濾的雙

37、重作用。一離心過濾的原理 料液首先進(jìn)入裝有過濾介質(zhì)的轉(zhuǎn)鼓中，然后被加速到轉(zhuǎn)鼓旋轉(zhuǎn)速度，形成附著在鼓壁上的液環(huán)。與沉降式離心機(jī)一樣，粒子受離心力而沉積，過濾介質(zhì)則阻止粒子的通過，形成濾餅。當(dāng)懸浮液的固體粒子沉積時，濾餅表面生成了澄清液，該澄清液透過濾餅層和過濾介質(zhì)向外排出。 間歇離心過濾二離心過濾的設(shè)備 離心過濾機(jī)設(shè)有一個開孔轉(zhuǎn)鼓，可以分離固體密度大于或小于液體密度的懸浮液。三離心過濾分離過程分析 以工業(yè)上常用的籃式(或筐式)過濾離心機(jī)為例，過濾器是半徑為R0的多孔圓筒，轉(zhuǎn)鼓的內(nèi)表面鋪有一層流動阻力較小的濾布，加料液連續(xù)地加入圓筒，被迅速旋轉(zhuǎn)的圓筒甩向內(nèi)壁，一方面形成恒定料液表面，離軸半徑為R1

38、，另一方面粒子積累于內(nèi)壁上形成濾餅，離軸的半徑為RC。 已知平板型過濾器操作時，通過濾餅的壓力降與流速成正比： = （2-29）式中l(wèi)為濾餅厚度；為料液黏度；為濾餅比阻；0為單位體積料液中固體的質(zhì)量。對于籃式離心機(jī)： 濾餅不是平板而呈圓柱形，壓力降隨半徑而變化，可用下式表示： = （2-30） 流體通過濾餅的流速也隨半徑而異，越接近鼓壁流速越小，可用下式表示： u = （2-31） 式中Q為濾液的體積流量，與位置無關(guān)，是常數(shù)；H為離心機(jī)的高度。 結(jié)合式(2-30)和式(2-31)，可得到： = （2-32） 將上式從Rc R0積分，可以得到濾餅層的壓力降： = （2-33） 在離心過濾中，造成

39、壓力降的推動力應(yīng)該是施加在流體上的離心力： = （2-34） 結(jié)合式(2-33)和式(2-34)便可求得通過濾餅的流體流量： Q = （2-35）體積流量Q并非常數(shù)，而是隨著濾餅厚度的變化而變化，濾餅厚度增加則RC減小，Q也減小，并且Q和RC都是時間的函數(shù)。 在離心過濾的計(jì)算中，所需求的是給定體積料液的過濾時間，因此要將上述公式進(jìn)行轉(zhuǎn)換，可利用Q的定義以及固體的質(zhì)量守恒公式來完成： Q = (2-36) = (2-37) 式中C為單位體積濾餅中固體的質(zhì)量；0為單位體積料液中所含固體的質(zhì)量。 將式(2-36)和式(2-37)代入式(2-35)后積分可得過濾時間： t = （2-38） 該式是得到

40、厚度為(R0-RC)的濾餅所需的過濾時間，常用于過濾操作的放大。 2.5.3 超離心法根據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量和形狀不同，應(yīng)用強(qiáng)大的離心力，將混合物中各組分分離、濃縮、提純的方法稱為超離心法。 應(yīng)用超離心技術(shù)中的差速離心、等密度梯度離心等方法，已經(jīng)成功的分離制取各種亞細(xì)胞物質(zhì)，如線粒體、微粒體、溶酶體、腫瘤病毒等。 超離心法是現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域研究中不可缺少的實(shí)驗(yàn)室分析和制備手段。 用5105g以上的強(qiáng)大離心力，長時間的離心(如17h以上)，可獲得具有生物活性的DNA、各種與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的酶系、各種mRNA和tRNA等，這為遺傳工程、酶工程的發(fā)展提供了必需基礎(chǔ)。一超離心技術(shù)的原理 超離心技術(shù)中

41、，由于使用的離心機(jī)類型是無孔轉(zhuǎn)鼓，所以也屬離心沉降，根據(jù)前面的討論，粒子在離心力場中進(jìn)行沉降的基本公式為： = （2-39） 如果粒子在離心力場中作勻速直線運(yùn)動，即： = （2-40） 結(jié)合上兩式并積分，便可求得在某種介質(zhì)中，使一種球形粒子從液體的彎月面沉降到離心管某部(如底部)所需的時間: t = （2-41） t = （2-41） 式中t為沉降時間；為懸浮介質(zhì)的黏度；d為粒子直徑；s為粒子密度；為介質(zhì)密度；r1為從旋轉(zhuǎn)軸中心到液體彎月面的距離；r2為從旋轉(zhuǎn)軸中心到離心管底部的距離。在某一轉(zhuǎn)速時，沉降一組均勻的球形顆粒所需要的時間與它們直徑的平方以及它們的密度和懸浮介質(zhì)的密度之差成反比，而與介質(zhì)的黏度成正比。 當(dāng)粒子直徑d和密度0不同時，移動同樣距離所需的時間不同，在同樣的沉降時間，其沉降的位置也不同，這是“微分離心”的基礎(chǔ)。 二超離心技術(shù)的分類 按照處理要求和規(guī)模，超離心技術(shù)分為：制備性超離心分析性超離心1制備性超離心 制備性超離心的主要目的是最大限度地從樣品中分離高純度目標(biāo)組分，進(jìn)行深入的生物化學(xué)研究。 制備性超離心分離和純化生物樣品一般使用以下方法： 差速離心法 一般密度梯度離心法 等密度離心法 粒子差速離心 (Differential Pelleting) 簡稱差速離心法，是采用逐漸